Laserquellen für 2- und 3-Photonen-Anregung verstehen

Die Vorteile der 2- und 3-Photonen-Anregung

Die Zwei-Photonen-Anregung ist ein etabliertes Werkzeug für die dreidimensionale Bildgebung, das heute in der Biowissenschaft, insbesondere im Bereich der Neurowissenschaften, weit verbreitet ist. Ein Ultrafast (normalerweise Femtosekunden-)Laser wird auf eine schmale Strahltaille fokussiert. Die hohe Spitzenintensität an dieser Stelle, und nur an dieser Stelle, kann die Zwei-Photonen-Anregung von fluoreszierenden Farbstoffen, Proteinen und endogenen Materialien antreiben. Durch Scannen dieses Laserpunkts in xyz kann ein zweidimensionaler Bildschnitt oder ein dreidimensionaler Bildwürfel mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und minimaler thermischer Auswirkung auf lebendes Gewebe aufgebaut werden.

Auf der Suche nach einer tieferen Neuronenkartierung innerhalb des Kortex hat die 3-Photonen-Anregung bei den Neurowissenschaftlern an Bedeutung gewonnen. Die Streuungs- und Absorptionseigenschaften der meisten Gewebe bieten verschiedene Fenster mit hoher Eindringtiefe bei den relevanten Wellenlängen. Die nichtlineare Anregung höherer Ordnung ergibt auch einen begrenzteren Fokus mit höherer Intensität in der Gewebeprobe, was zu sauberen Bildern mit praktisch keinem unscharfen Fluoreszenzhintergrund führt. Zusammen verdoppeln diese inhärenten Eigenschaften der 3-Photonen-Anregung die funktionale In-vivo-Bildgebungstiefe im Vergleich zu 2-Photonen-Techniken.  

2-Photonen- und 3-Photonen-Anregung haben jeweils ihre eigenen einzigartigen Laseranforderungen in Bezug auf Pulsenergie, Wellenlänge, Wiederholrate und Pulsbreite. Daher können die grundlegenden 2-Photonen- und 3-Photonen-Experimentaltechniken nicht durch dieselbe Lichtquelle angesprochen werden. Das Ziel dieses Whitepapers ist es, diese spezifischen Laseranforderungen eingehend zu untersuchen, hervorzuheben, wie sie jede Art von Anregung ermöglichen, und entsprechende Laserentwicklungen von Coherent vorzustellen, die sowohl 2-Photonen- als auch 3-Photonen-Anwendungen rationalisieren.

Laseranforderungen für die 2-Photonen-Mikroskopie

Die Zwei-Photonen-Anregung biologischer Proben erfordert kurze Pulse, hohe Wiederholraten für eine schnelle Rasterbildgebung, mittlere Leistungen, die mit der Lebensfähigkeit der Probe kompatibel sind, sowie Wellenlängen, die zu den Anregungsspektren der vielen verschiedenen verfügbaren Sonden passen. Die Anforderung an die Pulsdauer (Pulsbreite) entstammt der Notwendigkeit einer sehr hohen Spitzenleistung aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit der Zwei-Photonen-Anregung. Üblicherweise verwendete Pulsdauern liegen zwischen 75 und 250 fs, wobei kürzere Pulse zu einer effizienteren Anregung führen, jedoch ein höheres Risiko einer nichtlinearen Probe oder sogar einer ablativen Beschädigung bergen.

Solche kurzen Pulse können nur erzeugt werden, indem ein Laser im modengekoppelten Bereich betrieben wird. Die meisten modengekoppelten Laser arbeiten mit festen Wiederholraten von 50–100 MHz, was für viele Bildgebungsstudien sehr gut geeignet ist. Nimmt man beispielsweise eine typische Bildgröße von 512 x 512 Pixel und eine Bildrate von wenigen Hz, so werden mehrere Anregungspulse in jedem Pixel benötigt, um das Rauschen zu verringern, während die Energieleistung für das Rasterscannen Wiederholraten > 10 MHz erfordern. Schnellere resonant gescannte Experimente benötigen 10 MHz. 

Die am häufigsten verwendeten Indikatoren werden im Einzelphotonenbereich mit Wellenlängen zwischen 400 nm und 550 nm (violettes bis grünes Licht) angeregt. Im Zwei-Photonen-Bereich entspricht dies ungefähr Wellenlängen zwischen 750 nm und 1100 nm (nahe dem Infrarotbereich), die perfekt zu abstimmbaren Lasern auf Basis eines aktiven Titan-Saphir-Mediums passen.

Tabelle 1: Zusammenfassung optimaler Laserparameter für Mehrphotonenanregung.

Schließlich wurde in vielen verschiedenen Studien gezeigt, dass die meisten Proben durchschnittliche Laserleistungen von 100–200 mW bei diesen Wellenlängen nahe dem Infrarot-Bereich tolerieren; dies reicht aus, um helle Bilder mit einer Vielzahl heutiger bildgebender und funktioneller Fluoreszenzsonden zu liefern. Bei einigen Mikroskopen mit einem Durchsatz von nur 10 % bedeutet dies eine Anforderung von 1–2 Watt Laserleistung.

Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, werden diese Anforderungen von abstimmbaren und automatisierten Titan-Saphir (Ti:S)-Lasern als Single-Box, wie die Chameleon-Serie von Coherent, gut erfüllt. Insgesamt gibt es Schätzungen zufolge über 5.000 dieser Art von Ti:S-Lasern, die in Labors auf der ganzen Welt für die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet werden.

Laserquellen-Anforderungen für die 3-Photonen-Mikroskopie

Im Vergleich zur 2-Photonen-Mikroskopie steckt die 3-Photonen-Mikroskopie noch in den Kinderschuhen. Da es jedoch verschiedene Vorteile für die tiefere Bildgebung (z. B. in den Neurowissenschaften) bietet, nimmt seine Verwendung recht schnell zu.

Die Laseranforderungen werden durch die viel geringere Wahrscheinlichkeit eines 3-Photonen-Ereignisses bestimmt, das daher eine erheblich höhere Spitzenleistung als für die 2-Photonen-Anregung erfordert: ~ 100–200 mal höher. Höhere Spitzenleistungen können durch Verwendung eines Lasers mit kürzeren Pulsbreiten und/oder höheren Pulsenergien erreicht werden. Das Dispersionsmanagement – das Vermeiden von verzerrten und gestreckten Pulsen – wird jedoch zu einem Problem, wenn die kürzesten verfügbaren modengekoppelten (z. B. 10 fs) Pulse durch Mikroskopsysteme übertragen werden. Folglich bietet die Verwendung von 40–60-fs-Pulsen für die 3-Photonen-Anregung eine gute Balance zwischen hoher Spitzenleistung und einigermaßen einfachem Pulsmanagement. 

Diese Pulsdauer ist ~ 3-mal kürzer als die typische Pulsdauer eines 2-Photonen-Lasers und bedeutet, dass wir im Vergleich zu diesen Lasern immer noch eine 40–50-fache Erhöhung der Pulsenergie benötigen. Während 2-Photonen-Mikroskopielaser Ausgangspulsenergien im Bereich von 10–40 nJ haben, benötigt die 3-Photonen-Mikroskopie mit ähnlichen optischen Verlusten 0,5–2 mJ am Laserausgang.

Eine Möglichkeit, diese Pulsenergie zu erreichen, besteht darin, die Leistung eines Ti:S-Lasers mit einer Technik namens Chirpe-Puls-Verstärkung, abgekürzt CPA, zu verstärken. CPA wurde in den 1990er Jahren von Gerard Mourou und Donna Strickland erfunden. Dieses Verfahren ist so wichtig und allgegenwärtig, dass sie hierfür 2018 mit dem Nobelpreis für Physik ausgezeichnet wurden.

Ytterbium ist der Schlüssel zur Leistungsskalierung

Wie sieht es mit der Wiederholrate und der durchschnittlichen Leistung aus? Hier stellt die Lebensfähigkeit der Probe eine Hauptüberlegung dar. Aus zahlreichen 2-Photonen-Studien ist bekannt, dass die durchschnittliche Leistung der Probe unter 200 mW gehalten werden sollte, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten. Im vorherigen Abschnitt haben wir angegeben, dass die für die 3-Photonen-Bildgebung erforderliche Energie pro Puls 40–50-mal höher sein sollte als im Fall einer 2-Photonen-Anregung. Das bedeutet, dass die Wiederholrate entsprechend niedriger sein muss – sozusagen 1–2 MHz. Für eine schnellere Bildgebung könnte die Wiederholrate auf 4–5 MHz erhöht werden, aber nur, wenn die Energie pro Puls auf der Probe proportional verringert wird.

Leider machen die physikalischen Eigenschaften von Ti:S-Kristallen den Bau eines solchen Lasers unpraktikabel. Andererseits kann ein Lasersystem, das auf einer Ytterbium-dotierten Faser basiert, diese Probleme umgehen. Dies liegt daran, dass die Verwendung einer Yb-dotierten aktiven Faser die Verstärkung der Pulse über eine längere Distanz verteilt (die Faser kann gewickelt werden, um eine kompakte Konfiguration zu ergeben) und eine ausreichende Verstärkung auch bei den hohen Wiederholraten bietet, die mit einem Ti:S Verstärker nicht erreichbar sind.

Abb. 1 zeigt schematisch die typische Architektur dieses Typs von Yb-Faserverstärker. Wie bei Ti:S-Laserverstärkern erzeugt die erste Stufe (Seedlaser + Vorverstärker) einen Strom modengekoppelter Pulse mit einigen zehn MHz. Ein akusto-optischer Modulator (AOM) blendet diese Pulsfolge aus und senkt die Wiederholrate um eine ganze Zahl N. Unter Bezugnahme auf die Abbildung wird, wenn N = 50 ist, eine 1-MHz-Pulsfolge durch CPA in der Leistungsverstärkungsstufe verstärkt.

Diese Architektur ist äußerst flexibel und leistungsskalierbar; sie kann ohne weiteres durchschnittliche Leistungen von bis zu 60 Watt und mehr erzeugen, unterstützt bei jeder Wiederholungsrate von 1 MHz bis 50 MHz. Die Energie pro Puls wird durch den Beginn einer Beschädigung der optischen Faser begrenzt und typischerweise unter 100 mJ pro Puls gehalten.

Auf CPA basierende Yb-Laser arbeiten mit einer festen Wellenlänge von 1030–1070 nm und ihre Verstärkungsbandbreite kann Pulse von ~250 fs unterstützen. Weder die Wellenlänge noch die Pulsdauer sind direkt mit der 3-Photonen-Mikroskopie kompatibel und daher ist eine zusätzliche Pulsverarbeitung erforderlich, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Nebenbei bemerkt sind diese Yb-Laser für die 2-Photonen-Optogenetik mit sogenannten rotverschobenen Opsinen äußerst beliebt geworden, d.h. sie sind bei der Yb-Laserwellenlänge anregbar, wo ihre hohe Ausgangsleistung unter Verwendung von räumlichem Lichtmodulatoren über viele Neuronen "verteilt" wird.

Wellenlängenanforderungen für die 3-Photonen-Anregung

Für die 3-Photonen-Mikroskopie beträgt die zum Anregen von Sonden auf der Basis von grün fluoreszierendem Protein erforderliche Wellenlänge ~ 1300 nm; für rotverschobene Sonden beträgt sie ~1700 nm. Von diesen beiden Wellenlängenbereichen erweist sich 1300 nm als das vorteilhaftere 3-Photonen-Bildgebungs-"Fenster"; ein Aspekt, der später in diesem Artikel erläutert wird. Darüber hinaus erfordert eine effiziente 3-Photonen-Anregung auch Pulsbreiten von 40–60 fs. Wie erreichen wir diese Leistung mit Yb-Lasern?

Die beliebteste Methode zum Transformieren sowohl der Wellenlänge als auch der Pulsbreite, um die Anforderungen für die 3-Photonen-Mikroskopie zu erfüllen, ist die Verwendung eines wellenlängenabstimmbaren optischen parametrischen Verstärkers (OPA). Dieses Gerät wandelt die Pumpwellenlänge (vom Yb-Laser) in zwei längere Wellenlängen um, wobei die Summe ihrer Photonenenergie gleich der Photonenenergie des Pumplichts ist. Diese Energieerhaltung kann ausgedrückt werden durch:

                          1/λp=1/λs+1/λi

Wobei λ die Wellenlänge bezeichnet und p, s und i die "Pump"-Wellenlänge und die beiden vom OPA erzeugten Wellenlängen bezeichnen, die herkömmlich als "Signal"- und "Leerlauf/Idler"-Wellenlängen bezeichnet werden. Aus historischen Gründen ist der Idler immer die kürzere der beiden Wellenlängen.

Abbildung 2 zeigt schematisch, wie der OPA die erforderlichen Wellenlängen für die 3-Photonen-Mikroskopie erzeugt. Ein kleiner Teil der Yb-Laserleistung wird verwendet, um ein breitbandiges "Weißlicht-Kontinuum" in einer dünnen Platte zu erzeugen. Das weiße Licht wird dann in einem nichtlinearen Kristall verstärkt, der für die parametrische Verstärkung bei einer bestimmten, vom Benutzer ausgewählten Wellenlänge geeignet ist. Der Rest der Yb-Laserleistung wird frequenzverdoppelt, um grünes Licht bei 515–520 nm zu erzeugen; dies ist die „Pump“-Wellenlänge des OPA. Mit dieser Anordnung kann der OPA beispielsweise eine Leerlaufwellenlänge von 1300 nm erzeugen, was der 3-Photonen-Anregung gängiger "grüner" Sonden entspricht. Die Energieerhaltung erfordert, dass die Signalwellenlänge 860 nm beträgt.

Wie wählt der OPA-Benutzer angesichts der Weißlichtnatur des Kontinuums die beiden Ausgangswellenlängen aus? Dies wird durch Phasenanpassung erreicht, d. h. durch das Einstellen des Winkels zwischen der optischen Achse des Kristalls und dem Pumpstrahl. Durch Kippen des Kristalls kann ausgewählt werden, welches Wellenlängenpaar des weißen Lichts verstärkt wird. Abstimmbare OPAs haben einen manuell-gesteuerten oder motorisierten und computergesteuerten Tisch, um die Auswahl der gewünschten Signalwellenlänge zu vereinfachen.

Anpassung an die Pulsbreitenanforderung

Ein Aspekt, der genauso wichtig für die 3-Photonen-Mikroskopie ist: das spezifische Design des OPA ermöglicht die Erzeugung von Pulsen, die viel kürzer als der Pumppuls sind. Insbesondere durch Verwendung eines "nicht-kollinearen" Designs, bei dem sich der Pumpstrahl und der Signalstrahl in unterschiedlichen Winkeln im OPA-Kristall ausbreiten, können Pulse von nur 20–25 fs erzeugt werden. Dieser nicht-kollineare Ansatz hinterlässt eine Lücke von ~300 nm im Abstimmbereich, typischerweise zwischen 940 und 1250 nm. Glücklicherweise ist diese Region für die 3-Photonen-Anregung nicht relevant.

Aufgrund der beteiligten nichtlinearen Prozesse (Frequenzverdopplung des Yb-Lasers und parametrische Erzeugung) ist die Gesamtsystemeffizienz relativ gering. Hier zahlt sich die Leistungsskalierung von Yb-Lasern aus. Ein leistungsstarker Yb-Laser wie der Coherent Monaco liefert einige zehn µJ pro Impuls. Dies ergibt einige µJ pro Puls von einem OPA bei 1300 oder 1700 nm, was den optischen "Fenstern" für die 3-Photonen-Anregung entspricht. Abb. 3 zeigt eine typische Abstimmkurve für einen mit 60 Watt gepumpten OPA (Coherent Opera-F) bei 1 und 4 MHz – ein Setup, das von vielen Forschungsgruppen verwendet wird.

Gleichzeitige Bildgebung mit mehreren Sonden

In den vorherigen Abschnitten haben wir uns auf 1300 nm als Schlüsselwellenlänge bezogen, um wichtige Sonden wie grün fluoreszierende Proteine und die GCaMP-Familie genetisch codierter Calciumindikatoren in einer 3-Photonen-Modalität anzuregen, bei der 3 Photonen die gleiche Energie wie 2 Photonen bei 920 tragen nm. In ähnlicher Weise können sogenannte "rotverschobene" Sonden, die bei ~1050 nm mit 2-Photonen-Anregung angeregt werden, in der 3-Photonen-Modalität bei 1600–1700 nm angeregt werden. Zu diesen Sonden gehören die m-Fruit-Morphologie-Sonden und die RCaMP-Calcium-Sonden – siehe auch Abb. 4 

Während die überwiegende Mehrheit der 3-Photonen-Arbeiten bei 1300 nm durchgeführt wurde, ist die Verwendung von rotverschobenen Sonden, die theoretisch angenommen bei der längeren Wellenlänge von 1600–1700 nm anregbar sind, in der Mikroskopie-Community immer noch von Interesse. Dies scheint darauf hinzudeuten, dass ein idealer 3-Photonen-Laser in der Lage sein sollte, im Falle einer zweifarbigen Anregungsabbildung beide Wellenlängen, vielleicht sogar gleichzeitig, zu erzeugen. Die längere Wellenlänge hat aufgrund der geringeren Gewebestreuung das Potenzial für eine noch tiefere Bildgebung, obwohl die Wasserabsorption bei 1700 nm höher ist als bei 1300 nm, was bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit einer thermischen Beschädigung der Probe höher ist.

Mehrere veröffentlichte Studien haben jedoch gezeigt, dass 1300 nm verwendet werden können, um sowohl grün als auch rot fluoreszierende Sonden oder zumindest eine gewisse Anzahl von ihnen anzuregen. Die Fluoreszenzemission von den zwei Sonden wird dann einfach unter Verwendung wellenlängenselektiver Filter getrennt. Beispielsweise veröffentlichte Chris Xu im Jahr 2021 einen wegweisenden Artikel über die 3P-Anregung von mehrfarbigen Fluorophoren mit einer einzigen Wellenlänge (Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain | Science Advances). 

Erst kürzlich haben Timo van Kerkoerle und seine Doktorandin Marie Guillemant die gleichzeitige Erregung von mit Dextran und tdTomato markierten Maus-Interneuronen im präfrontalen Kortex (eine rotverschobene Sonde) durch 3P-Anregung mit einem auf 1300 nm abgestimmten Coherent Monaco und Opera-F erreicht (Abbildung 5). Das Z-Stapel-Bild in Abbildung 4 zeigt ein signifikantes Signal von den rotverschobene Sonden sogar bis zu einer Tiefe von ~1 mm.

Dieser Ansatz macht nicht nur zwei OPAs überflüssig, sondern auch den Bedarf für einen OPA mit Wellenlängenabstimmung. Um eine einfachere Implementierung dieses Mehr-Sonden-Ansatzes zu ermöglichen, hat Coherent eine One-Box-Quelle mit fester Wellenlänge für 1300-nm-Femtosekundenpulse eingeführt, die als Coherent Monaco 1300 bezeichnet wird. Diese kompakte Quelle ist ein vollständig integrierter, Hands-Free Laser mit einer Ausgangsleistung von bis zu 2,5 W, einer Auswahl von 1, 2 oder 4 MHz Wiederholraten und einer Pulsbreite von <50 fs. All diese Parameter passen ideal zur tiefen 3-Photonen-Bildgebung, sodass die Coherent Monaco 1300 die erste schlüsselfertige Single-Box-Lichtquelle ist, die speziell auf die 3-Photonen-Mikroskopie ausgerichtet ist. 

In Anbetracht des Aufkommens und der zunehmenden Beliebtheit der 3-Photonen-Bildgebung wurden in das Design des Coherent Monaco 1300 die Vorteile für den Benutzer integriert, die auch in den fortschrittlichsten Lasern für die 2-Photonen-Mikroskopie, wie dem Coherent Chameleon Discovery und Axon enthalten sind. Tatsächlich verfügt der Coherent Monaco 1300 in einer einzigen Box über die Total Power Control (TPC)-Option, die On-the-Fly-Leistungsdämpfung/Gating bietet, sowie die Compact Pulse Compressor (CPC)-Option, die eine Dispersionsvorkompensation für eine optimale Pulsbreite bei der Probe mit jeder Art von Mikroskopaufbau bereitstellt.