ARTIKEL
Ytterbium-Faserlaser ermöglichen
Neurowissenschaften auf höchstem Niveau
Ultrafast Quellen mit neuen Fähigkeiten und verbesserten, benutzerfreundlichen Funktionen
Überblick
Die neurowissenschaftliche Forschung an Mäusen stellt ein wichtiges Anwendungssegment für die Multiphotonenmikroskopie dar. Dieser Artikel gibt einen Einblick in das Feld. Es werden einige interessante Untersuchungsbereiche behandelt. Um zu verstehen, wie kortikale Neuronennetzwerke weit unter der Oberfläche des Hirngewebes funktionieren, wurden rotverschobene Funktionssonden entwickelt, die in Kombination mit tiefer eindringenden, langen (d. h. > 1 Mikrometer) Laserwellenlängen verwendet werden. In letzter Zeit wächst das Interesse an der optogenetischen Photoaktivierung im großen Maßstab und an der Drei-Photonen-Anregung für ultratiefe Bilder, die beide sehr photonenhungrig sind. Ti: Saphir-Laser können diese Anforderungen nicht ohne Weiteres erfüllen. Daher haben sich die Laserhersteller für Ytterbium-dotierte Faserlaser entschieden. Diese bieten mehrere Vorteile, insbesondere die Skalierbarkeit der Leistung und die Flexibilität der Wiederholrate.
Abbildung 1: Die Eindringtiefe von Ultrafast Lasern in lebendes Hirngewebe wird durch eine Kombination aus Streuung und Absorption begrenzt. Es gibt zwei optimale Durchdringungsfenster, die bei 1.300 und 1.700 nm liegen. Basierend auf einer privaten Kommunikation mit Professor Chris Xu, Cornell University.
Ytterbium-Faserlaser
Ytterbium-Faserlaser liefern eine feste Wellenlänge bei etwa 1.040 nm, wobei die Abstimmung im nahen Infrarot mit einem optischen parametrischen Gerät erfolgt. Bei den 80 MHz Wiederholraten, die typischerweise für die Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet werden, wird ein optischer parametrischer Oszillator (OPO) im Laserkopf eingesetzt, um eine breite Wellenlängenabstimmung (660 nm bis 1.320 nm) zu ermöglichen. Dies ermöglicht eine effiziente Zwei-Photonen-Anregung sowohl von kurzwelligen als auch rotverschobenen fluoreszierenden Sonden und Proteinen. Ein wichtiger zusätzlicher Vorteil dieser Art von Ein-Box-Quelle ist, dass der Benutzer Zugang zu zwei verschiedenen Ausgangswellenlängen hat: den festen Yb-Ausgang bei 1.040 nm und den durchstimmbaren OPO-Ausgang für optogenetische und andere Arten von „Zwei-Wellenlängen“-Experimenten. Die Leistung beträgt in der Regel 1–3 W in jedem Kanal.
Im Gegensatz zu Ti:Saphir-Lasern ist die Leistung von Ytterbium-Fasern in Faserlasern leicht skalierbar, um Verstärker mit sehr flexiblen Wiederholraten (bis zu 10 MHz) zu schaffen. Diese sind für die Stimulation größerer Neuronenpopulationen gut geeignet. Anwendungen, die eine hohe Leistung und Wellenlängenabstimmung erfordern, wie z. B. die Drei-Photonen-Bildgebung, werden dann durch Hinzufügen eines optischen parametrischen Verstärkers (OPA) erfüllt. Einige der jüngsten Fortschritte verdeutlichen die Konvergenz der Lasertechnologie mit den sich ändernden Bedürfnissen der Neurowissenschaftler. Einige davon sind im Folgenden aufgeführt.
Vorteile von Ytterbium
Im Gegensatz zu Ti:Saphir-Lasern ist die Leistung von Ytterbium-Fasern in Faserlasern leicht skalierbar, um Verstärker mit sehr flexiblen Wiederholraten (bis zu 10 MHz) zu schaffen. Diese sind für die Stimulation größerer Neuronenpopulationen gut geeignet.
Tiefere 3-Photonen-Bildgebung
Ein übergreifendes Thema in den Neurowissenschaften ist die Abbildung der gesamten (> 1 mm) Tiefe des Mauskortex bis hinunter zum Hippocampus. Es gibt zwei breite Infrarot-„Fenster“, in denen die Laserpenetration und die Gewinnung von Fluoreszenzsignalen maximiert werden: bei 1,3 und 1,7 µm (Abb. 1). Glücklicherweise ist das 1,3 µm-Fenster ideal für Sonden mit Drei-Photonen-Anregung, die auf grün fluoreszierenden Proteinen basieren, und das 1,7 µm-Fenster ist ideal für Sonden, die auf rot fluoreszierenden Proteinen basieren, wie Tdtomato. Darüber hinaus dringen diese Wellenlängen auch recht gut durch dünne Knochen, so dass in einigen Fällen kein Schädelfenster aus Glas erforderlich ist.
Die Drei-Photonen-Bildgebung bei diesen Wellenlängen wird jetzt durch Ytterbium-Faserverstärker ermöglicht, die einen abstimmbaren optischen parametrischen Verstärker pumpen. Bei herkömmlichen OPAs ist die interne Architektur entweder für kurze Pulse oder eine breite Wellenlängenabstimmung optimiert. Die Drei-Photonen-Bildgebung erfordert jedoch idealerweise beides. Die neuesten OPAs, die für diese Anwendung entwickelt wurden, verwenden daher ein hybrides Design, bei dem eine nicht-kollineare Stufe die kurzen Pulse (komprimierbar auf 50–70 fs) erzeugt, gefolgt von einer kollinearen Stufe, die eine sehr breite Wellenlängenabstimmung ermöglicht.
Ein Team unter der Leitung von Jack Waters am Allen Institute (Seattle, WA) hat diese Art von Verstärker plus OPA verwendet, um auf diese Weise Drei-Photonen-Bildgebung durchzuführen und zu beobachten, wie der Kortex der Maus neuromodulatorische Signale verarbeitet, die durch visuelle Reize ausgelöst werden. Das Ziel von Waters war es, so viel wie möglich von der Hirnrinde zu erfassen. Das 1.300 nm Laserlicht wird recht gut durch den Mäuseschädel übertragen, so dass sie kein Glasfenster benötigen und das Bild über einen großen Bereich des Kortex kühlen können. Die Daten aus den Studien sind in Abbildung 2 dargestellt.
Überwachung der Ca2+ Aktivität in größeren Neuronenpopulationen
Die maximale Pulswiederholrate für diesen OPA-Typ beträgt derzeit 2 MHz. Für einige Anwendungen sind jedoch bereits noch höhere Wiederholungsraten erforderlich, z. B. um die Signalübertragung (durch Messung der Ca2+-Aktivität) aller Neuronen in einem Zielhirnvolumen oder zumindest aller Neuronen in mehreren Betrachtungsebenen zu überwachen. Die Abbildung größerer Neuronenpopulationen in Echtzeit erfordert zwangsläufig eine schnellere Abtastung und eine höhere Leistung, um die geringeren Verweilzeiten auszugleichen.
Eine kürzlich erschienene Arbeit von Aliphasha Vaziri und Mitarbeitern mehrerer US-amerikanischer und europäischer Institute hat erfolgreich einen neuartigen Weg aufgezeigt, um diese Art der groß angelegten Überwachung zu erreichen und gleichzeitig die Auflösung einzelner Neuronen beizubehalten [1]. Sie benutzten 920 nm Pulse, um eine Zwei-Photonen-Anregung eines gewöhnlichen Kalzium-Indikators, GCAMP6m, mit einigen cleveren Innovationen durchzuführen. Sie verwendeten eine Kombination aus temporaler Fokussierung (TeFo) und konventioneller Fokussierung, um die fokussierte Strahltaille an die typischen Abmessungen eines einzelnen Neurons anzupassen. Um ein großes Volumen an Neuronen zu überwachen, entschieden sie sich für ein intelligentes Scanning, bei dem ein Laserpuls pro Voxel (d. h. ein Puls pro Neuron) eingesetzt wird. Sie brauchten also eine hohe Pulsenergie. Außerdem wollten diese Forscher eine Pulswiederholrate von mehr als 4 MHz, um eine Multihertz (3–160 Hz) Betrachtungsgeschwindigkeit zu erreichen. Da OPAs diese Geschwindigkeit noch nicht erreicht haben, haben sie einen Ytterbium-Faserverstärker verwendet, um ein abstimmbares Ultrafast Gerät der nächsten Generation zu pumpen. Dieses wird als optischer parametrischer gechirpter Pulsverstärker (OPCPA) bezeichnet. Das Gerät bietet Ausgangsgeschwindigkeiten bis zu mehreren MHz und wird durch einen cleveren Chirp-Offset abgestimmt. Dieser OPCPA-Typ ist jetzt auch als Single-Box-Produkt erhältlich. Der Ytterbium-Faserverstärker bei ihm ist vollständig in den Kompaktkopf integriert.
Abbildung 2: Bild des Allen-Instituts von der Kalziumaufnahme durch einen intakten Mäuseschädel. (A) Schematische Darstellung der Präparation ohne Acryl- oder Deckglas. (B) Zeitliche mittlere Projektion einer Emx1-IRES-Cre;- CaMk2a-tTA;Ai94 Maus. 10 Hz Bildwiederholrate. 3P-Anregung bei 1.300 nm durch einen intakten Schädel, etwa 300 µm dick. Mikroskop fokussiert 450 µm unterhalb der Pia. (C) Spontane Kalziumtransienten von GCaMP-exprimierenden Somata (Kreise in Tafel B). Anregungsquelle: Coherent (Monaco) Verstärker mit Coherent (Opera) OPA.
Abbildung 3: Ein Beispiel für eine Kalziumaufnahme mit hoher Bildwiederholrate. Neuronen, die RCaMP1.07 exprimieren, angeregt bei 1.040 nm, in vivo, Maus. Anregungsquelle Chameleon Discovery TPC. Mit freundlicher Genehmigung von Weber Lab, Universität Zürich.
Photo-Aktivierung größerer Neuronen-Populationen
Die Zwei-Photonen-Absorption von Opsin-Proteinen, die in Neuronen exprimiert werden (d. h. Multiphotonen-Optogenetik), wird zunehmend eingesetzt, um Neuronen mit der Auflösung eines einzelnen Neurons zu aktivieren und/oder auszuschalten. Dies kann mit der Multiphotonen-Kalzium-Bildgebung kombiniert werden, um ein Netzwerk von Neuronen mit der Auflösung eines einzelnen Neurons anzuregen und zu überwachen – manchmal auch als „rein optische Physiologie“ bezeichnet. Der ursprüngliche Pionier der Optogenetik, Karl Deisseroth, steht auch bei der Entwicklung der optogenetischen Zwei-Photonen-Stimulation und -Stilllegung an vorderster Front. Seine Gruppe an der Stanford University ist führend in der Anwendung der Zwei-Photonen-Anregung zu diesem Zweck.
Auch hier sind Leistung und Geschwindigkeit die Herausforderungen. Der 1.035 nm Ausgang eines Ytterbium-Verstärkers eignet sich jedoch perfekt für die Zwei-Photonen-Anregung von Opsinen mit kurzer Wellenlänge, ohne dass irgendeine Art von abstimmbarer optischer parametrischer Vorrichtung erforderlich ist. Die hohe Geschwindigkeit (0,4–50 MHz) unterstützt selbst die schnellsten Experimente. Jim Marshel aus dem Deisseroth-Labor meint: „10 MHz scheint eine optimale Pulsrate zu sein, die eine effiziente Photoaktivierung von Dutzenden und vielleicht Hunderten von Neuronen in chronischen Langzeitstudien ermöglicht. Die hohe Leistung und das schnelle Pulsieren der neuesten Ytterbium-Faserverstärker sind eine gute Ergänzung für diese Anwendung.“
Direkte Modulation der Laserleistung
Die Fortschritte in der Neurowissenschaft werden nicht nur durch neue Verstärkermaterialien und neuartige parametrische Gerätearchitekturen für innovative Studien unterstützt, sondern auch bestehende Mainstream-Anwendungen der Zwei-Photonen-Bildgebung profitieren von neuen Ansätzen für die praktische Umsetzung. Ein Beispiel hierfür sind die Laseroszillatoren. Ein wichtiger Bestandteil eines kompletten Multiphotonenmikroskops ist die Technologie zur Steuerung der Laserleistung vor dem Mikroskop-Scankopf. Dies ist eine Voraussetzung für eine optimale Leistung selbst bei einfachen Experimenten mit Rasterabtastung – die Laserleistung sollte vollständig blockiert werden, wenn der Mikroskop-Scankopf den Strahlenpunkt für den nächsten y-Scan zurückführt (Fly-back). Dies ist auch eine wichtige Funktion für Anwendungen, bei denen große z-Stacks gescannt werden. Da das System tiefer in das Gewebe fokussiert, erfordert die natürliche Dämpfung eine höhere Laserleistung, um die Bildintensität konstant zu halten. In immer ausgefeilteren Hochgeschwindigkeits-Scanprotokollen kann die Leistungssteuerung dazu verwendet werden, die optimale Leistungsstufe im Verhältnis zur Voxel-Verweildauer beizubehalten.
Die Steuerung der Hochgeschwindigkeitsleistung hat sich sowohl für die Hersteller von OEM-Mikroskopen als auch für den großen Anteil der Anwender, die ihre eigenen Multiphotonenmikroskope bauen, als Herausforderung erwiesen. Konkret geht es darum, wie die Strahlleistung in Echtzeit angepasst werden kann, ohne die Pulsbreite übermäßig zu strecken (Chirping) oder die Qualität des runden, gaußförmigen Strahls zu beeinträchtigen, der für hochauflösende Bilder erforderlich ist.
Die neueste Generation von Ytterbium-basierten Lasern bietet jetzt eine vollständige unabhängige Kontrolle sowohl des abstimmbaren Strahls als auch des Strahls mit fester Wellenlänge, bevor sie den Laserkopf verlassen, d. h. mit garantierter Pulsbreite und TEM00-Strahlqualität (M2 < 1,1). Akusto-optische Modulatoren (AOMs) können verwendet und extern über einen 0–10 V Analogeingang gesteuert werden, was ideal für selbstgebaute Mikroskope ist, oder über einen direkten RF-Eingang zu den AOMs, um Kosten und Komplexität für OEM-Mikroskophersteller zu minimieren. Eine Anwendung, die von der Hochgeschwindigkeitsstrommodulation profitiert, ist die Kalziumbildgebung mit schneller Bildwiederholrate (Abb. 3).
Zusammenfassung
Die rasante Entwicklung von molekularen Sonden und Bildgebungsmethoden in Synergie mit ergänzenden Fortschritten in der Lasertechnologie treibt die Multiphotonenmikroskopie zu neuen Höchstleistungen an. Neurowissenschaftler nutzen diese Fortschritte, um den Stand der Technik in Bezug auf Bildauflösung, Bildtiefe und Funktionsfähigkeit zu verbessern, während sie weiterhin die Geheimnisse des Gehirns entschlüsseln.
„10 MHz scheint eine optimale Pulsrate zu sein. Sie ermöglicht eine effiziente Photoaktivierung von Dutzenden und vielleicht Hunderten von Neuronen in chronischen Langzeitstudien. Die hohe Leistung und das schnelle Pulsieren der neuesten Ytterbium-Faserverstärker sind eine gute Ergänzung für diese Anwendung.“
– Jim Marshel – Neurowissenschaftler, Standford University School of Medicine – Deisseroth Lab
Zugehörigkeiten
1. Darryl McCoy, Coherent UK Ltd., Glasgow, Vereinigtes Königreich
2. Marco Arrigoni, Coherent, Inc., Santa Clara, CA, USA