文章
掺镱光纤激光器助力
尖端神经科学<
具有新功能和增强易用特性的超快光源
综述
基于小鼠的神经科学研究代表了多光子显微镜的主要应用领域。 本文主要会通过研究一些有趣的方向和大家一睹这一领域的奥秘。 在探索以了解大脑皮层神经元网络如何在脑组织表面以下精确运行的过程中，开发了红移功能探针；这些探针与穿透更深的长激光波长（即大于 1 微米）结合使用。 最近，超深图像的大规模光遗传学光活化和三光子激发引起了越来越多的关注，这两种技术都需要光子。 钛 宝石激光器无法轻松满足这些需求，因此激光器制造商转向掺镱光纤激光器，该激光器具有多项优势，突出的优势是功率调节和重复频率捷变。
图 1： 超快激光在活脑组织中的穿透深度受散射和吸收的联合限制。 有两个适宜的穿透窗口，分别是中心波长为 1300 和 1700 nm 的位置。 基于与康奈尔大学 Chris Xu 教授的私下交流。
掺镱光纤激光器
镱光纤激光器提供大约 1040 nm 的固定波长输出，通过光学参量器件实现近红外调谐。 在通常用于双光子成像的 80 MHz 重复频率下，激光头内使用光学参量振荡器 (OPO) 以提供宽波长调谐（660 nm 至 1320 nm）。 这可实现短波长和红移荧光探针及蛋白的高效双光子激发。 这种一体式光源的另一个重要优势是用户可以使用两种不同的输出波长： 1040 nm 的固定 Yb 输出和用于光遗传学和其他类型“双波长”实验的可调谐 OPO 输出。 每个输出通道的功率通常为 1-3 W。
与钛宝石不同，掺镱光纤易于调整功率，从而创建不仅重复频率非常灵活（高达 10 兆赫兹），而且适合激发更大神经元群的放大器。 然后，可以通过加入光学参量放大器 (OPA) 来满足需要高功率和波长调谐的应用，例如三光子成像。 最近的一些新进展突出了激光技术与神经科学界不断变化的需求的融合；下面概括介绍了其中的几项进展
掺镱优势
与钛宝石不同，掺镱光纤易于调整功率，从而创建不仅重复频率非常灵活（高达 10 兆赫兹），而且适合激发更大神经元群的放大器。
更深的 3 光子成像
神经科学的一个首要主题是对小鼠大脑皮层直到海马体的整个深度（大于 1 mm）进行成像。 有两个具有高激光穿透和荧光信号提取的宽红外“窗口”： 1.3 和 1.7 µm（图 1）。 幸运的是，1.3 µm 窗口适合基于绿色荧光蛋白的三光子激发探针，而 1.7 µm 窗口适合基于红色荧光蛋白（例如 Tdtomato）的探针。 此外，这些波长还可以很好地穿透薄骨，在某些情况下无需玻璃颅窗。
这些波长的三光子成像现在可以通过泵浦可调谐光学参量放大器的掺镱光纤放大器实现。 对于传统 OPA，内部架构已针对短脉冲或宽波长调谐进行了优化。 但三光子成像理论上都需要这两部分。 因此，为此应用设计的新型 OPA 采用了混合设计，其中的非共线级生成短脉冲（可压缩到 50-70 fs），其后面的共线级提供极宽波长调谐。
艾伦研究所（华盛顿州西雅图）的 Jack Waters 领导的一个团队一直在使用这种类型的放大器和 OPA 以这种方式进行三光子成像，以观察小鼠大脑皮层如何处理由视觉刺激物触发的神经调节信号。 Waters 的目的是尽可能深入地研究大脑皮层。 1300 nm 激光可以相当好地穿过小鼠颅骨进行传播，因此不需要窗和大面积大脑皮层的冷图像。 图 2 显示了通过他们的研究得到的数据。
监测较大神经元群中的 Ca2+ 活性
此类 OPA 的脉冲重复频率上限目前为 2 MHz。 但有些应用已经需要更高的重复频率，例如，监测目标脑体积中所有神经元或至少若干个观察平面中的所有神经元的信号传递（通过测量 Ca2+ 活性）。 对较大的神经元群进行实时成像不可避免地需要更快的扫描和更高的功率，以此补偿停留时间的缩短。
Aliphasha Vaziri 和多家美国欧洲研究所的合作者最近发表了一篇论文，该论文成功地展示了一种新方法，在实现这种大规模监测的同时，还可保持单神经元分辨率 [1]。 他们使用 920 nm 脉冲，利用几种巧妙的创新技术，对一种常用钙指示剂 GCAMP6m 进行了双光子激发。 他们结合使用了时间聚焦 (TeFo) 和传统聚焦方法，将聚焦束腰与单个神经元的典型尺寸相匹配。 为了监测大量神经元，他们选择使用了每个体素针对一个激光脉冲（即每个神经元一个脉冲）的智能扫描技术。 因此，他们需要高脉冲能量。 此外，这些研究人员还需要高于 4 MHz 的脉冲重复频率，以便达到变频 (3-160 Hz) 查看速度。 由于 OPA 还没有达到这个速率，他们使用了掺镱光纤放大器来泵浦下一代光参量啁啾脉冲放大器 (OPCPA) 的可调谐超快器件。 该器件可提供高达数 MHz 的输出速度，并通过巧妙的啁啾偏移进行调谐。 此类 OPCPA 现在也可作为一体式产品提供，镱光纤放大器与紧凑头部完全集成。
图 2： 艾伦研究所的穿过完整小鼠颅骨的钙成像图像。 (A) 没有亚克力或盖玻片的制备示意图。 (B) Emx1-IRES-Cre;- CaMk2a-tTA;Ai94 小鼠的时间平均投影。 10 Hz 帧速率。 1300 nm 下穿过完整颅骨的 3P 激发，厚度约为 300 µm。 显微镜聚焦在软脑膜下方 450 µm。 (C) 表达 GCaMP 的胞体的自发钙瞬变（图 B 中的圆圈）。 激发源： 具有相干公司 (Opera) OPA 的相干公司 (Monaco) 放大器。
图 3： 快速帧速率钙成像的示例。 在 1040 nm 激光激发下表达 RCaMP1.07 的神经元，小鼠活体内。 激发源 Chameleon Discovery TPC。 苏黎世大学 Weber 实验室供图。
较大神经元群的光活化
神经元中表达的视蛋白的双光子吸收（即多光子光遗传学）越来越多地用于以单神经元分辨率执行神经元的活化和/或默化。 这可以与多光子钙成像相结合，以单神经元分辨率激发和监测神经元网络（有时称为“全光学生理学”）。光遗传学的最初先驱 Karl Deisseroth 在开发双光子光遗传学刺激和默化技术方面也走在最前沿。 他的斯坦福大学小组最先在此研究中使用了双光子激发。
研究中遇到的挑战仍然是功率和速度。 不过，掺镱放大器的 1035 nm 输出完全契合短波长视蛋白的双光子激发，无需任何类型的可调谐光学参量器件。 高速度 (0.4-50 MHz) 甚至支持极快速的实验。 根据 Deisseroth 实验室的 Jim Marshel 的说法，“10 MHz 似乎是可在慢性长期研究中对数十甚至数百个神经元进行有效光活化的适宜脉冲频率。 新型掺镱光纤放大器的高功率和快速脉冲非常适合这种应用。”
直接激光功率调制
用于前沿研究的新型放大器材料和新型参量器件架构不仅为神经科学的进步提供了支持，而且新的实际实施方法也让现有的主流双光子成像应用从中受益。 激光振荡器就是这方面的一个示例，完整的多光子显微镜的一个重要组成部分是控制显微镜扫描头上游激光功率的技术。 这就要求即使是在简单的光栅扫描实验中，也要实现优异的性能 – 激光功率应彻底隔断，因为显微镜扫描头返回光束斑（回扫），以进行下一次 y 轴扫描。 这对于扫描大型 z 堆栈的应用也是一个重要功能；随着系统的焦点逐步深入组织，自然衰减也不断增大，因此就需要提高激光功率来维持恒定的图像强度。 在越来越复杂的高速扫描状态中，功率控制可以用来根据体素停留时间保持优异的功率水平。
事实证明，高速功率控制对于 OEM 显微镜制造商和大部分自制多光子显微镜的用户来说都是一个挑战。 具体来说，难点在于如何在不过度拉伸（啁啾）脉冲宽度或损害高分辨率图像所需的圆形高斯光束质量的情况下实时调整光束功率。
新一代掺镱激光器现在可以使可调谐光束和固定波长光束离开激光头之前得到独立的控制，也就是说，可以提供有保证的脉冲宽度和 TEM00 光束质量 (M2 < 1.1)。 声光调制器 (AOM) 可通过适合自制显微镜 0-10V 模拟输入加以利用和从外部进行控制，或通过 AOM 的直接 RF 输入尽可能降低 OEM 显微镜制造商的成本和复杂性。 受益于高速功率调制的一个应用是快速帧速率钙成像（图 3）。
总结
分子探测和成像方法的快速发展与激光技术的互补性进步相辅相成，将多光子显微镜的性能推向了新高度。 在不断揭示大脑奥秘的过程中，神经科学家正在利用这些进步逐步提高图像分辨率、深度和功能能力。
“10 MHz 似乎是可在慢性长期研究中对数十甚至数百个神经元进行有效光活化的适宜脉冲频率。 新型掺镱光纤放大器的高功率和快速脉冲非常适合这种应用。”
-Jim Marshel - 神经科学家，斯坦福大学医学院 - Deisseroth 实验室
作者单位
1. Darryl McCoy，Coherent UK Ltd.，英国格拉斯哥
2. Marco Arrigoni, Coherent, Inc.，美国加利福尼亚州圣克拉拉