암세포 분석 – 최신 동향
레이저 혁신과 스마트한 계측기 혁신의 결합은 유방암 세포와 관련해 잠재적으로 중요한 진단 데이터에 새로운 고처리량 경로를 제공하고 있습니다.
2023년 7월 31일, 작성: Coherent
Flow Cytometry(유세포 분석)란 무엇인가요?
Flow Cytometry에서 세포 또는 기타 생물학적 입자는 하나 이상의 집속 레이저 빔과 교차하는 상호 작용 영역을 통해 강제로 한 줄로, 그리고 고속으로 흐르게 됩니다. 그 결과로 생기는 레이저 여기 형광 강도(대개 산란된 레이저 광선 강도)가 모든 세포에 대해 기록됩니다. 이렇게 하면 계수기에서 대규모 세포 집단을 신속하게 분석할 수 있습니다(예: 세포 중 특정 유형의 세포가 몇 퍼센트인지 확인). 분류도 지원하도록 구성된 계측기에서, 표적 유형의 세포는 다시 각 세포의 형광/산란 시그니처를 기준으로 전기장을 사용하여 세포를 용기로 편향시켜서 개별적으로 수집됩니다.
Flow Cytometry는 빠르게 수행할 수 있으므로 여러 다양한 응용 분야에 적합합니다. 예를 들어 전혈구 계산치(즉, “CBC”)와 같은 혈구 분석을 위해 의학에서 광범위하게 사용됩니다. 또한 종종 혈구 이외의 다른 유형의 포유류 세포를 분석하기 위해 연구소 및 신약 개발에서도 사용됩니다. 때로는 바닷물 속의 아주 작은 유기체를 연구하고 축산업에서 정자를 성별 분류(예: 젖소의 경우 암컷 개체의 생산을 촉진하기 위한 목적)하는 데 사용됩니다.
더 많은 파장 및 자외선 파장 사용
Flow Cytometry는 수십 년 동안 사용되어 왔지만 상당히 역동적인 분야입니다. 많은 수의 다양한 매개변수에서 세포를 분석하기 위해 12가지의 서로 다른 레이저 파장이 사용되는 “다중 매개변수 Flow Cytometry”가 대세를 이루고 있습니다. 레이저 제조업체는 여러 레이저를 턴키 광 엔진에 패키징할 뿐만 아니라 새로운 파장의 레이저를 모두 공통 형식으로 제공함으로써 이러한 추세를 지원하고 있습니다. (Coherent의 OBIS 제품 라인에는 이 두 가지 개발 사항이 모두 구현되어 있습니다.)
또 다른 추세는 자외선(UV) 레이저 파장 사용이 증가하고 있다는 것입니다. 이러한 자외선 레이저 파장을 통해 다중 매개변수 개념을 확장할 수 있으며 자가형광 사용도 가능해집니다. 자가형광은 형광 염료 또는 기타 첨가제를 사용하지 않고도 천연적으로 형광을 발하는 세포에서 발견되는 물질을 말합니다. 이러한 물질에는 몇 가지 중요한 대사 산물인 NAD(P)H 및 FAD가 포함됩니다.
시간을 이용하여 문제를 파악한 연구 사례
이전에 소개된 Coherent 성공 사례에서는 Jessica Houston 교수(뉴멕시코 주립 대학교)가 이끄는 연구팀이 시간 분해 Flow Cytometry의 개발 및 사용에 있어서 선구자인 이유에 대해 설명했습니다. 그리고 이 연구팀의 경우는 세포 수를 계산할 수 있을 뿐만 아니라 대사 상태도 파악할 수 있기 때문에 NAD(P)H 및 FAD를 표적으로 삼고 있다는 점에 대해서도 논의했습니다. Houston 박사는 다음과 같이 설명합니다. “대부분의 Flow Cytometry 측정은 형광 신호의 강도를 기반으로 합니다. 그러나 얼마나 많은 형광색소가 세포의 표면이나 내부에 결합되어 있는지를 포함하여 이러한 측정에 노이즈 및 오차가 유입될 수 있는 많은 요인이 있습니다. 우리는 또한 각 세포에서 형광 신호의 감쇠 시간을 살펴보기로 결정했습니다. 수명은 농도와 관계가 없으며 자가형광을 담당하는 형광색소 또는 천연(내생) 물질의 화학적 상태에 따라 달라집니다. 내생적 형광은 세포의 대사 상태에 대한 고유한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 이러한 정보를 사용하여 세포가 정상적으로 기능하는지 혹은 변형된(암성) 세포인지를 판단할 수 있습니다.”
이 연구팀은 특히 NAD(P)H 및 FAD에 관심을 가지고 있습니다. 그 이유는 NAD(P)H 및 FAD의 형광 수명이 이러한 보조 인자가 단백질에 결합되어 있는지 여부를 나타내기 때문입니다. 결과적으로 이는 세포가 에너지를 얻기 위해 주로 산화적 인산화 및 해당과정이라는 절차에 의해 어떻게 당을 산화시키고 있는지를 나타냅니다. 보고서에 따르면 대부분의 암세포와 그 이외의 “결점이 있거나” 손상된 세포에서 높은 수준의 “자유롭고” 결합되지 않은 NAD(P)H가 측정되었으며, 이는 세포가 해당과정이라는 덜 효율적인 절차를 통해 에너지를 만들고 있음을 보여주는 것입니다. 광학적으로 측정된 NAD(P)H 대비 FAD 양의 비율은 세포의 대사 활동을 나타내며 산화환원 비율이라고 합니다.
CW 레이저를 사용한 묘책
처음에 Houston 교수의 연구팀에서는 시간 종속적 데이터를 얻기 위해 레이저 빔의 펄스를 사용했습니다. 이 경우에 계측기는 두 가지 방법 중 하나로 형광 펄스의 감쇠를 기록합니다. 즉, 레이저 여기가 꺼져 있을 때 실시간 감쇠 곡선으로 또는 레이저가 매우 빠른 속도로 반복적으로 변조될 때 주파수 영역에서 이러한 감쇠를 기록합니다. 이 후자의 방법이 바로 이 연구팀이 FAD를 모니터링하기 위해 375nm의 파장에서 OBIS 레이저를 사용했던 방법입니다. 그러나 전체 산화환원 비율을 정확하게 파악하려면 원칙적으로는 FAD와 NAD(P)H를 모두 측정해야 합니다. 그리고 NAD(P)H 형광 감쇠 시간을 독립적으로 측정하려면 UV(약 349nm)에서 더 많은 여기가 필요합니다.
nFLIC 방법의 핵심 개념. 세포가 불균일한 빔 프로파일을 통과함에 따라 형광이 오르내립니다. 여기 프로파일 대비 위상 지연은 형광 수명의 직접적인 척도입니다. 그래픽 자료는 Houston 교수의 연구실에서 제공되었습니다.
최근에 Coherent는 349nm 출력으로 개발된 새로운 OBIS 모델을 Houston 교수의 연구팀에게 공급했습니다. 하지만 이 모델은 375nm 레이저와는 다른 내부 기술을 사용하며 직접 변조하는 것이 간단하지 않습니다. 그럼에도 Houston 교수의 연구팀에게는 문제가 되지 않았습니다. 왜냐하면 몇 년 전에 이 연구팀은 평균 형광 수명을 파악하기 위해 연속파(CW) 레이저를 사용하는 nFLIC(비변조 형광 수명 세포 분석)라는 스마트한 기법을 개발했기 때문입니다.
그림 1은 이 nFLIC가 어떻게 작동하는지 보여줍니다. 완벽한 TEM00 출력 빔이 탑재된 레이저를 사용하면 세포가 포커스를 통과할 때 여기 확률이 가우시안 빔 프로파일에 걸쳐 오르내립니다. 그러나 0이 아닌 형광 감쇠 시간은 FPD(형광 펄스-지연)라는 현상을 일으킵니다. 세포가 빔을 통과함에 따라 형광 강도는 가우시안 여기 프로파일보다 천천히 줄어듭니다. 그리고 Houston 교수의 연구팀은 FPD가 세포의 평균 형광 수명에 대한 유효한 표현임을 엄밀하게 증명했습니다.
새로운 OBIS 375는 우수한 출력 빔 품질을 갖추고 있기 때문에 Houston 교수의 연구실에서 수행한 nFLIC 연구에 매우 효과적이었습니다. Houston 교수는 다음과 같이 설명합니다. “우선, 우리가 필요로 하는 아주 깔끔한 TEM00 빔 형태를 갖추고 있습니다. 또한 소음이 매우 낮은 레이저입니다. 그리고 마찬가지로 중요한 것으로서 출력, 빔 형태 및 빔 포인팅도 매우 안정적입니다. 특수 형광 비드를 사용하여 형광 펄스-감쇠와 형광 수명 간의 관계를 확실하게 보정할 수 있기 때문에 이러한 요소가 중요합니다.”
암세포 저항성
암세포는 기타 강력한 화학 요법 약물에 대한 저항성을 발달시키는 경우가 많기 때문에 강적이라고 할 수 있습니다. CYTO 2023 컨퍼런스(캐나다 몬트리올에서 개최)에서 Houston 교수의 연구실 소속 대학원생인 Samantha Valentino는 타목시펜(Tamoxifen)이라는 화학 요법 약물에 대한 유방암 저항성을 모니터링하기 위한 강력한 도구로서 FAD/NADH 형광 수명 및 산화환원 비율을 파악하는 데 있어 시간 분해 Flow Cytometry 사용의 가치를 설명하는 훌륭한 발표를 보여주었습니다.
MCF 유방암 세포와 T47D 유방암 세포에 대한 형광 수명 데이터 – 민감성 세포주와 저항성 세포주의 비교. 그래픽 자료는 Houston 교수의 연구실에서 제공되었습니다.
특히 그녀는 타목시펜은 널리 사용되는 약물로 “에스트로겐 수용체 양성”으로 특징지어지는 유방암 치료에 효과가 있다고 구체적으로 설명했습니다. 이 약물은 병을 완화시키는 데 사용됩니다. 한편, 저항성은 일반적으로 치료를 시작한 후 2~5년 이내에 나타납니다. Valentino는 산화환원 비율이 약물에 저항하는 암과 같은 더 공격적인 암세포에서 더 왜곡되는 경우가 많다는 점도 언급했습니다. 또한 Valentino는 두 가지 다른 유방암 유형(MCF-7 및 T47D)을 연구했으며, 이 두 경우 모두에서 타목시펜에 민감한 암 세포주와 타목시펜에 저항하는 세포주를 비교했습니다. 그림 2는 결과를 요약한 것으로, Houston 교수의 연구팀이 사용한 접근법이 민감성 세포 유형과 저항성 세포 유형에서 통계적 유의차를 나타냈음을 보여주고 있습니다. 약물-저항성 특성과 관련해 암세포 집단을 신속하게 분석하는 기능이 항암 무기에서 중요한 새로운 도구(신약 개발과 연구 모두에 해당)가 될 수 있고, 개선된 환자별 치료법을 제공할 수 있다는 것은 두말할 나위가 없습니다.
요약
Flow Cytometry, DNA 시퀀싱, 미세조직 생검 등과 같은 레이저 여기 형광을 기반으로 한 분석 기법은 최근 COVID-19 팬데믹으로 인해 더욱 가속화된 개인 맞춤형 의료의 추세를 뒷받침하는 필수적인 도구가 되어 가고 있습니다. Coherent는 속도와 데이터 품질을 개선하고 사용 장벽을 낮추며 전체 계측기 비용을 줄여주는 레이저 도구를 통해 이러한 기법의 발전을 지원하기 위해 최선을 다하고 있습니다.
