뉴멕시코 주립대학교: 시간 분해 Flow Cytometry

과제

미국 뉴멕시코 주립대학교의 제시카 휴스턴 교수 연구팀은 시간 분해 측정이 Flow Cytometry에 사용될 수 있는 독특한 방법을 연구합니다. 이 연구팀의 주요 초점 영역은 화학 요법이 존재하는 상태에서 형광 수명 측정을 사용하여 암세포의 대사를 매핑(활성도 평가)하는 것입니다. 또 다른 주요 응용 분야는 푀르스터(형광) 공명 에너지 전달(FRET) 및 형광 단백질을 사용하여 기본 세포 신호 전달과 수용체 활동을 목표로 합니다.

휴스턴 교수는 시간 분해 Flow Cytometry는 계수 및 정렬 기능을 수행하기 위해 정상 상태 형광 강도 데이터에 의존하는 대부분의 기존 Flow Cytometry 응용 분야와 확연히 다르다고 주장합니다. 또한 정상 상태 데이터에 최적화된 상업용 흐름세포측정기는 휴스턴 교수의 연구에 적합하지 않습니다. 그래서 휴스턴 교수 연구팀은 첫 번째 단계로 자체 흐름세포측정기를 만들어야 했습니다.

이미 알려진 형광 수명 측정법에는 두 가지 방법, 즉 펄스 레이저나 광원을 사용하여 시간 영역에서 측정하는 방법과 주파수 영역에서 측정하는 방법이 있습니다. 휴스턴 교수는 다음과 같이 설명합니다. "예를 들어 혈액 내 전이암 세포를 연구하기 위해 많은 양의 세포를 비파괴적으로 세거나 분류하기 위해서는 처리량이 높은 흐름세포측정기가 필요합니다. 또한 광자 계수를 사용하는 시간 영역 측정은 필요한 처리량을 지원하지 않습니다. 그래서 우리는 여기 레이저에 변조를 적용하고 변조된 형광 방사에서 관찰된 위상 변이를 연관시키는 주파수 영역에서 연구하기로 결정했습니다."

솔루션

휴스턴 교수 연구팀은 NADH 및 FAD와 같은 대사산물에서 내인성 형광을 관찰하는 것 외에도 다양한 형광체를 사용하여 연구하고자 했습니다. 그래서 연구팀에게는 이 모든 다른 표적을 효율적으로 여기시키기 위해 여러 레이저 파장이 필요했습니다. 또한 연구팀에게는 빔 포인팅과 출력 노이즈 측면에서 모드 품질이 좋은 레이저, 즉 M2가 낮고 출력 안정성이 높은 레이저가 필요했습니다.

신중한 평가를 거친 후, 연구팀은 Coherent의 OBIS 레이저를 사용하기로 결정했습니다. 휴스턴 교수는 이렇게 설명합니다. "우리는 현재 375nm, 405nm, 488nm, 633nm를 포함한 여러 OBIS 레이저를 보유하고 있습니다. 이 스마트 레이저들은 우리 연구에 적합합니다. 고품질 출력 외에도 우리 연구에 필요한 빠르고 직접적인 디지털 변조를 지원하며, 동일한 형태와 적합성을 가진 플러그 앤 플레이 레이저를 쉽게 추가하고 제거할 수 있습니다." 휴스턴 교수는 수십 밀리와트의 가용성, 심지어 수백 밀리와트의 가용성이 또 다른 중요한 OBIS의 기능이라고 덧붙였습니다. 이는 휴스턴 교수의 여러 실험이 기본적으로 디지털 변조가 흐름 셀의 레이저 출력을 50%까지 떨어뜨리는 주파수 영역 수명 측정에 기초하기 때문입니다.

결과

휴스턴 교수는 맞춤 제작된 흐름세포측정기와 증가하는 OBIS 레이저 컬렉션이 성공적인 조합임이 입증되었으며 연구팀의 대사 프로파일링 연구와 FRET 연구를 위한 많은 데이터를 이미 전달했다고 설명했습니다.

대사 프로파일링을 위해 휴스턴 교수는 측정된 형광 수명이 평가되는 세포에서 이 대사물이 주로 결합 상태인지 또는 비결합 상태인지에 따라 달라지는 NADH의 예를 인용했습니다. 이것은 세포가 세포 활동의 대부분을 지원하는 에너지 분자인 ATP를 생성하는 방법과 관련이 있습니다. 정상 세포의 대사 활동은 주로 ATP를 생성하기 위해 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS)에 의존합니다. 그러나 해당과정은 많은 유형의 암세포에서 ATP 생성에 더 큰 역할을 하며 OXPHOS 용량은 감소합니다. 따라서 휴스턴 교수 연구팀은 예를 들어 세포가 새로운 치료에 어떻게 반응하는지에 대한 정량적인 지표로 NADH 수명을 사용할 수 있습니다.

또한 연구팀은 정량적 FRET 데이터의 빠른 수집을 위해 시스템을 이용하고 있습니다. 연구팀은 단백질 형태 연구를 위해 단백질과 단백질의 상호 작용을 더 잘 이해하고 효소 작용을 연구하기 위해 이 데이터를 분석하고 있습니다. 휴스턴 교수는 이렇게 말합니다. "우리는 기증자 형광체가 진정되지 않은 상태에 있는지 여부와 같은 것들을 볼 수 있습니다. 또한 기증자 배출과 수용체 배출을 모두 포착할 수 있습니다. 다시 말하지만, 이 데이터는 암 치료의 효과를 나타낼 수 있습니다. 결론적으로, OBIS 레이저와 높은 처리량의 세포측정기는 실제로 풍부한 데이터를 제공하고 있습니다."

참고 문헌:

1. J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin, and J. P. Houston, "Toward the Development of an On-Chip Acoustic Focusing Fluorescence Lifetime Flow Cytometer," Frontiers in Physics, 2021 9:253 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.647985
2. A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino, and J. P. Houston, "A Review of New High-Throughput Methods Designed for Fluorescence Lifetime Sensing From Cells and Tissues," Frontiers in Physics, 2021 9:163 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.648553
3. K. Nichani, J. Li, M. Suzuki, and J. P. Houston, “Evaluation of caspase-3 activity during apoptosis with fluorescence lifetime-based cytometry measurements and phasor analyses,” Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275; PMC7738394  
4. F. Alturkistany, K. Nichani, K. D. Houston, and J. P. Houston, “Fluorescence lifetime shifts of NAD(P)H during apoptosis measured by time-resolved flow cytometry,” Cytometry A 2019; 95(1):70-79 PMC6587805 

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