Washington Universität: Dual-Laser-Multiphotonen-Mikroskop für die Immunologie und andere Forschungszwecke

Die Herausforderung

Dr. Mark Miller, Außerordentlicher Professor und Direktor des In Vivo Imaging Core an der Washington Universität für Medizin in St. Louis, verfügt über eine langjährige Erfahrung im Bau und Einsatz von Multiphotonenmikroskopen, insbesondere für den Einsatz in intravitalen Immunitätsstudien. Dazu gehören wegweisende Untersuchungen zum Leukozyten-Transport und zur Antigenpräsentation sowie die neuartige Nutzung der Computerbiologie. So zeigte seine Gruppe zum Beispiel erstmals, dass das Schwärmen von T-Zellen relativ zu APC-Zielen (Antigen-präsentierende Zellen) nicht von Chemokine-Gradienten dominiert wurde, sondern eher mit zufälligen Bewegungen begann (Miller et al., Science 2002, Miller et al., PNAS, 2004, Miller et al. JEM, 2004).

Seit 2012 fungiert er auch als Direktor des In Vivo Imaging Core, wo er die Errichtung eines universellen Multiphotonenmikroskops mit offenem Zugang für interdisziplinäre Forscher zur Durchführung von Einzelzellbildgebung bei der Untersuchung von Infektionskrankheiten in vivo in die Wege geleitet hat. Ein Hauptziel bestand darin, zwei unabhängig voneinander abstimmbare Wellenlängen einzubeziehen (Zinselmeyer et al., Methods Enzymology, 2009), um flexible Experimente mit mehreren Fluorophoren zu ermöglichen. Weitere Voraussetzungen waren eine einfache Bedienung des Lasers, um eine breite Benutzerbasis zu unterstützen, und eine hohe Zuverlässigkeit, um eine effiziente Planung für mehrere Benutzer zu ermöglichen.

Die Lösung

Dr. Miller entschied sich schließlich dafür, ein handelsübliches Endoskope zu modifizieren und es mit zwei Chameleon Vision II-Lasern auszustatten, teilweise aufgrund umfangreicher positiver Erfahrungen mit früheren Chameleon Ultra-Lasern in seinem Immunologielabor. Er fügt hinzu, dass er sich für die Vision II-Modelle entschieden hat, da diese den längsten Wellenlängen-Direktabstimmbereich aller Titan:Saphir-Laser bieten. „Damit steht unseren Mitarbeitern eine breite Palette von Anregungsoptionen zur Verfügung, darunter 800 nm für Autofluoreszenz, 900 nm für grün (und cyan) fluoreszierende Proteine und 1040 nm für die Verwendung mit rot fluoreszierenden Proteinen der mfruit-Serie. Der lange Wellenlängenbereich ist auch nützlich, um Autofluoreszenz und Lichtschäden in Experimenten mit lebendem Gewebe zu minimieren, die lange Aufnahmezeiten erfordern.”

Dr. Miller merkt an, dass der innovative Service-/Ersatzvertrag ein weiterer Schlüsselfaktor bei der Wahl des Lasers war. „Wir hatten ein paar Probleme mit den Lasern der frühen Generation. Aber Coherent hat uns sofort wieder zu 100 % der spezifizierten Leistung gebracht, wobei die einzige Ausfallzeit buchstäblich die Zeit war, einen Ersatzlaser an mein Labor zu schicken.“ Obwohl er überhaupt keine Probleme mit den Vision II-Lasern hatte, erklärt er, dass der Vertrag nichtsdestotrotz eine unschätzbare Sicherheit bietet und den ununterbrochenen Betrieb des vielbeschäftigten Bildgebungszentrums ermöglicht.

Das Ergebnis

Dr. Miller stellt fest, dass das Dual-Laser-Mikroskop ein uneingeschränkter Erfolg in Bezug auf Leistung, Zuverlässigkeit und Einfachheit der Bedienung ist. Neue Benutzer können das System in der Regel schon nach wenigen Stunden praktischer Schulung bedienen. Dieses Instrument hat Daten für Dutzende von Veröffentlichungen zu den verschiedensten Themen geliefert. Dr. Miller hat eine beeindruckende Präsentation auf YouTube veröffentlicht, die eine Vielzahl von Bildern und Videos aus seiner langjährigen Arbeit mit der intravitalen Multiphotonen-Bildgebungsmethode enthält.

Referenzen:

Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.

Miller MJ, Wei SH, Parker I, Cahalan MD. Science. 2002 Jun 7;296(5574):1869-73. doi: 10.1126/science.1070051. Epub 2002 May 16.

T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Miller MJ, Hejazi AS, Wei SH, Cahalan MD, Parker I. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 27;101(4):998-1003. doi: 10.1073/pnas.0306407101. Epub 2004 Jan 13.

Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.

Miller MJ, Safrina O, Parker I, Cahalan MD. J Exp Med. 2004 Oct 4;200(7):847-56. doi: 10.1084/jem.20041236.

Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.

Zinselmeyer BH, Dempster J, Wokosin DL, Cannon JJ, Pless R, Parker I, Miller MJ.

Methods Enzymol. 2009;461:349-78. doi: 10.1016/S0076-6879(09)05416-0.

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