New Mexico State University: Zeitaufgelöste Durchflusszytometrie

Die Herausforderung

Die Forschungsgruppe von Professorin Jessica Houston an der New Mexico State University untersucht die einzigartigen Möglichkeiten, die zeitaufgelöste Messungen in der Durchflusszytometrie bieten. Ein wichtiger Schwerpunkt der Gruppe ist die Kartierung des Stoffwechsels von Krebszellen – die Bewertung ihrer Vitalität – in Gegenwart von Chemotherapeutika unter Verwendung von Messungen der Fluoreszenzlebensdauer. Eine weitere wichtige Anwendung zielt auf die grundlegende Zellsignalisierung und Rezeptoraktivität ab, wobei Förster-(Fluoreszenz-)Resonanzenergietransfer (FRET) und Fluoreszenzproteine verwendet werden.

Houston stellt fest, dass sich die zeitaufgelöste Durchflusszytometrie deutlich von den meisten bestehenden Durchflusszytometrie-Anwendungen unterscheidet, die sich auf Daten zur Fluoreszenzintensität im stationären Zustand verlassen, um Zähl- und Sortierfunktionen auszuführen. Und die handelsüblichen Durchflusszytometer, die für stationäre Daten optimiert sind, eignen sich nicht für ihre Forschung. Als ersten Schritt musste ihre Gruppe also ihr eigenes Durchflusszytometer bauen.

Es gibt zwei bekannte Methoden zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern: im Zeitbereich unter Verwendung eines gepulsten Lasers oder einer anderen Lichtquelle oder im Frequenzbereich. Houston erklärt: „Wir brauchen ein Durchflusszytometer mit hohem Durchsatz, um große Zellpopulationen zerstörungsfrei zu zählen und/oder zu sortieren, z. B. um metastasierende Krebszellen im Blut zu untersuchen. Und Messungen im Zeitbereich mittels Photonenzählung würden den erforderlichen Durchsatz nicht ermöglichen. Daher haben wir uns entschieden, im Frequenzbereich zu arbeiten, wo die etablierte Methode darin besteht, eine Modulation auf den Anregungslaser anzuwenden und die beobachtete Phasenverschiebung in der modulierten Fluoreszenzemission zu korrelieren.“

Die Lösung

Die Gruppe in Houston wollte die Möglichkeit haben, zusätzlich zur Untersuchung der endogenen Fluoreszenz von Metaboliten wie NADH und FAD eine Vielzahl verschiedener Fluorophore in ihrer Arbeit zu verwenden. Sie benötigten also mehrere Laserwellenlängen, um all diese verschiedenen Ziele effizient anzuregen. Außerdem brauchten sie Laser mit einer guten Modenqualität, d. h. mit einem niedrigen M2-Wert, sowie mit einer hohen Stabilität der Leistung, sowohl in Bezug auf die Strahlführung als auch auf das Leistungsrauschen.

Nach sorgfältiger Prüfung entschieden sie sich für die OBIS-Laser von Coherent. Houston bemerkt: „Wir haben derzeit mehrere OBIS-Laser mit Wellenlängen von 375 nm, 405 nm, 488 nm und 633 nm. Diese intelligenten Laser sind perfekt für unsere Arbeit. Zusätzlich zu ihrer hochwertigen Leistung unterstützen sie die schnelle direkte digitale Modulation, die wir für unsere Arbeit benötigen, und es ist so einfach, diese Plug & Play-Laser, die alle die gleiche Form und Größe haben, hinzuzufügen und zu entfernen." Sie merkt an, dass die Verfügbarkeit von 10er und sogar 100er Milliwatt ein weiteres wichtiges Merkmal von OBIS ist. Das liegt daran, dass viele ihrer Experimente auf Lebensdauermessungen im Frequenzbereich beruhen, bei denen die digitale Modulation die Laserleistung an der Fließzelle um 50 % reduziert

Das Ergebnis

Houston erklärt, dass sich ihr speziell angefertigtes Durchflusszytometer und ihre wachsende Sammlung von OBIS-Lasern als erfolgreiche Kombination erwiesen haben und bereits zahlreiche Daten sowohl für ihre Studien zum metabolischen Profiling als auch für die FRET-Arbeiten geliefert haben.

Für die Erstellung von Stoffwechselprofilen führt sie das Beispiel von NADH an, bei dem die gemessene Fluoreszenzlebensdauer davon abhängt, ob dieser Metabolit in der untersuchten Zelle hauptsächlich in gebundenem oder ungebundenem Zustand vorliegt. Dies hängt damit zusammen, wie die Zelle ATP erzeugt, das Energiemolekül, das den Großteil der zellulären Aktivitäten antreibt. Stoffwechselaktivitäten in normalen Zellen beruhen in erster Linie auf der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) in den Mitochondrien, um ATP zu erzeugen. Bei vielen Arten von Krebszellen spielt die Glykolyse jedoch eine größere Rolle bei der ATP-Produktion, und die OXPHOS-Kapazität ist reduziert. So kann die Houston-Gruppe die NADH-Lebensdauer als quantitativen Maßstab dafür verwenden, wie die Zellen beispielsweise auf neue Behandlungen reagieren.

Die Gruppe nutzt das System auch für die schnelle Erfassung quantitativer FRET-Daten. Sie analysieren diese Daten, um Protein-Protein-Wechselwirkungen besser zu verstehen, um die Konformation von Proteinen zu studieren und um die Wirkung von Enzymen zu untersuchen. Houston merkt an: „Wir können zum Beispiel feststellen, ob sich ein Donor-Fluorophor in einem gelöschten Zustand befindet oder nicht. Wir können auch sowohl Spender- als auch Empfängeremissionen erfassen. Auch diese Daten können einen Hinweis auf die Wirksamkeit von Krebstherapien geben. Unterm Strich liefern die OBIS-Laser und unser Hochdurchsatz-Zytometer wirklich eine Fülle von Daten.“

Referenzen:

1. J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin, and J. P. Houston, „Toward the Development of an On-Chip Acoustic Focusing Fluorescence Lifetime Flow Cytometer,“ Frontiers in Physics, 2021 9:253 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.647985
2. A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino, and J. P. Houston, „A Review of New High-Throughput Methods Designed for Fluorescence Lifetime Sensing From Cells and Tissues,“ Frontiers in Physics, 2021 9:163 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.648553
3. K. Nichani, J. Li, M. Suzuki, and J. P. Houston, “Evaluation of caspase-3 activity during apoptosis with fluorescence lifetime-based cytometry measurements and phasor analyses,” Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275; PMC7738394  
4. F. Alturkistany, K. Nichani, K. D. Houston, and J. P. Houston, “Fluorescence lifetime shifts of NAD(P)H during apoptosis measured by time-resolved flow cytometry,” Cytometry A  2019; 95(1):70-79 PMC6587805 

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