客户成功案例
新墨西哥州立大学： 时间分辨流式细胞术
挑战
新墨西哥州立大学 Jessica Houston 教授的研究团队研究了时间分辨测量可用于流式细胞术的独特方式。 该研究团队关注的一个重要领域是癌细胞的代谢图谱，即在化疗药物作用的情况下，使用荧光寿命测量法评估癌细胞的活力。 另一个关键应用是使用 Förster（荧光）共振能量转移 (FRET) 和荧光蛋白来对基本细胞信号和受体活性进行靶向研究。
Houston 指出，时间分辨流式细胞术与大多数现有的流式细胞术应用明显不同，后者依赖稳态荧光强度数据来执行计数和分选功能。 而市面上销售的针对稳态数据进行了优化的流式细胞仪并不适合她的研究。 因此，她的团队必须首先构建自己的流式细胞仪。
有两种测量荧光寿命的已知方法： 在时域中或在频域中使用脉冲激光或其他光源。 Houston 解释说，“我们需要一个高通量流式细胞仪，以便对大量细胞进行非破坏性计数和/或分选，例如，用于研究血液中的转移性癌细胞。 而使用光子计数的时域测量无法支持必需的高通量。 所以我们决定转向频域，其中的既定方法是对激发激光进行调制，与观测到的调制荧光发射相位转移相关联。”
解决方案
除了观察 NADH 和 FAD 等代谢物的内源性荧光外，Houston 团队还希望能够在他们的工作中使用大量不同的荧光团。 因此，他们需要多个激光波长来有效激发所有这些不同的靶材。 他们还需要具有良好的光束质量（即低的M2）以及能够在光束指向和功率噪声方面提供高稳定性输出的激光器。
经过仔细评估，他们决定使用Coherent OBIS 激光器。 Houston 指出，“我们目前使用了几种 OBIS 激光器，波长分别为 375 nm、405 nm、488 nm 和 633 nm。 这些智能激光器非常适合我们的工作。 除了高质量输出外，它们还支持我们在工作中进行快速直接的数字调制，并且添加和移除这些即插即用激光器也非常容易，它们的外形和尺寸都相同。”她指出，OBIS的另外一个重要指标是它可以有数十甚至数百毫瓦的功率输出。 这是因为她的许多实验都基于频域寿命测量，其中数字调制实质上能够将流动室处的激光功率降低 50%
成果
Houston 表示，她的定制型流式细胞仪和不断增加的 OBIS 激光器系列已被证明是一个成功的组合，并且已经为她的代谢分析研究和 FRET 工作提供了大量数据。
对于代谢分析，她引用了 NADH 的例子，其中测量的荧光寿命取决于该代谢物在接受评估细胞中主要是处于结合状态还是未结合状态。 这与细胞如何产生 ATP 相关，ATP 是为大多数细胞活动提供动力的高能分子。 正常细胞的代谢活动主要依靠线粒体氧化磷酸化 (OXPHOS) 来产生 ATP。 但在许多类型的癌细胞中，糖酵解在 ATP 产生中发挥着更大作用，并且 OXPHOS 能力会降低。 因此，Houston 团队可以使用 NADH 寿命作为定量指标来衡量细胞对新疗法的反应。
团队还使用该系统快速获取定量 FRET 数据。 他们正在分析这些数据，以便更好地了解蛋白质-蛋白质相互作用，进行蛋白质构象研究并探索酶的作用。 Houston 指出，“我们可以观察诸如供体荧光团是否处于淬灭状态之类的事情。 我们还可以捕获供体和受体发射。 同样，该数据可以表明癌症治疗的有效性。 总之，OBIS 激光器和我们的高通量细胞仪确实提供了丰富的数据。”
参考文献：
- J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin, and J. P. Houston, "Toward the Development of an On-Chip Acoustic Focusing Fluorescence Lifetime Flow Cytometer," Frontiers in Physics, 2021 9:253 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.647985
- A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino, and J. P. Houston, “A Review of New High-Throughput Methods Designed for Fluorescence Lifetime Sensing From Cells and Tissues," Frontiers in Physics, 2021 9:163 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.648553
- K. Nichani, J. Li, M. Suzuki, and J. P. Houston, “Evaluation of caspase-3 activity during apoptosis with fluorescence lifetime-based cytometry measurements and phasor analyses,” Cytometry A, 2020 97(12):1265-1275; PMC7738394
- F. Alturkistany, K. Nichani, K. D. Houston, and J. P. Houston, “Fluorescence lifetime shifts of NAD(P)H during apoptosis measured by time-resolved flow cytometry,” Cytometry A 2019; 95(1):70-79 PMC6587805
“OBIS 激光器支持我们在工作中进行快速直接的数字调制，并且添加和移除这些即插即用激光器非常容易，它们的外形和尺寸都完全相同， 能够提供大量数据。”
— Jessica Houston，美国新墨西哥州拉斯克鲁塞斯，新墨西哥州立大学化学与材料工程系 (CHME) 教授。
图 1. 时间分辨流式细胞仪的关键元件。
图 2. 组装时间分辨流式细胞仪。