激光显微镜是生物学研究的重要工具

光学显微镜在生命科学领域的应用可以追溯到荷兰商人安东·范·列文虎克 (Anton van Leeuwenhoek)。列文虎克首次使用光学显微镜观察到了微小的生命形式，并因此举世闻名。之后的大约 400 年里，从事生命科学研究的科学家们仍然把光学显微镜作为工作中的关键工具。这项技术经久不衰，令人印象深刻。“microscopic”这个词更是长期以来被人们普遍接受，用于指代任何微小的事物。

工作中的 3D 显微镜。小鼠颈动脉，利用 Chameleon Discovery 激光器发出的两种波长，几种细胞成分以不同的色彩显示出来。主图显示颈动脉“正面”，右侧的垂直切片是动脉壁的正交视图。

用显微镜描绘生命

为什么光学显微镜仍然如此重要？这与激光有什么关系？ 可以说，光学显微镜是对小事物的结构进行成像的最简单仪器。但另一个同样重要的原因是，光学显微镜已经发展成为唯一可以告诉我们这些结构的构成成分的仪器。通过操纵和测量与样本相互作用的光的颜色（波长），科学家们可以绘制出各种不同生化物质的图谱。因为每一个生物体，无论是单细胞变形虫、大树还是大象，其生命都是基于复杂的生化反应，这是一种非常有用的能力。

过去，这种化学图谱绘制相当粗糙。一百年前，人们会用一种称为着色剂的有色染料对死亡植物或动物的样本（“固定样本”）进行化学处理。着色剂可能会附着在样品中的所有脂肪上，或者所有蛋白质上。然后观察者可以看到样本的哪些部分被这种染料染色，哪些部分没有。

今天的科学家有无数种染料可以选择，而他们的研究也远比以前复杂。现在使用的大部分染料是荧光化学物质，通常称为荧光团或荧光染料。（荧光材料吸收一种波长的光，并以另一种更长的波长重新发射光。） 有些荧光团只是装在瓶子里的化学物质，但大多数情况下是植物或动物经过基因改造，直接生成的荧光蛋白。

激光是终极显微镜光源

但是激光器呢？ 好吧，我们现在就要讲一讲这个问题。原来，我们之所以说激光是实现荧光显微镜的终极光源，是有几个原因的。科学家们希望使用显微镜看到更清晰的细节。我们称之为空间分辨率，或简称分辨率。他们还想观察真实的三维事物，而不仅仅是薄薄的死体切片。他们还想使用显微镜实时观察活体生物。事实证明，激光作为一种光源，可以帮助实现所有这些目标。

激光为荧光显微镜带来了几个绝对优势。首先，激光只发射一种波长的光。而且，通过采用我们的光泵浦半导体激光 (OPSL) 技术，在一定程度上可选择该波长，以匹配特定荧光团的吸收波长。显微镜摄像头前方的玻璃滤光片会阻挡样本散射的激光（即眩光），并确保只对荧光进行选择性成像。现在，您可以使用灯或带滤光片的 LED 获得单个波长。但是激光输出光束的聚焦光斑比任何灯或 LED 所发出光的光斑都要小得多。这是共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 的关键优势，它可以提供 3D 图像，而不会出现妨碍三维成像的离焦背景荧光。

激光的强度也比灯或 LED 高得多，所以即使是微弱的荧光也能快速成像。此外，激光的高强度和可调节强度特性是实现最新超分辨率技术（例如 PALM 和 STORM）的关键，此类技术可以生成分辨率低至几纳米的图像。此项技术在 2014 年获得了诺贝尔奖，因为就在 40 年前，人们还认为可见光显微镜永远无法超过衍射的硬极限，即大约 250 纳米。

活体成像

在生命科学的许多领域，尤其是神经科学领域，研究人员希望成像深度与分辨率一样高。他们希望获得组织内部甚至整个生物体内部深处的清晰图像。他们想在活体组织上进行成像。尽管共焦和超分辨率方法非常适合固定样本，但它们通常会对活体样本造成过多的光损伤。幸运的是，有一种技术叫做多光子显微镜，能够应对超快激光器带来的这个挑战。（又一个诺贝尔奖！）。事实上，这是超快激光器的一项非常重要的应用，因此，Coherent 高意推出了 Chameleon 超快激光器系列，该系列专为多光子显微镜量身定制。

展望未来，科学家们正在开发用于医学应用的工具，例如基于多光子显微镜的实时活检。这是可能实现的，因为一些多光子方法甚至根本不需要染料或荧光蛋白！这些统称为无标记成像。

激光显微镜对生物学产生了巨大影响，以上不过是管中窥豹而已。我们认为如果列文虎克知道了这个，肯定会感到非常惊喜和印象深刻，因为我们也是这个感觉！